Сиалилтрансферазы и их применение в получении сиалированных олигосахаридов - RU2020105821A

1. Способ получения сиалированных олигосахаридов, включающий следующие стадии:

a) предоставление по меньшей мере одной генетически модифицированной клетки, которая содержит гетерологичную сиалилтрансферазу, причем указанная гетерологичная сиалилтрансфераза способна обладать α-2,3-сиалилтрансферазной активностью и/или α-2,6-сиалилтрансферазной активностью для переноса остатка сиаловой кислоты от ее нуклеотид-активированной формы в качестве донорного субстрата к акцепторной молекуле, при этом акцепторная молекула выбрана из группы, состоящей из лактозы, лакто-N-триозы II и олигосахаридов грудного молока;

b) культивирование по меньшей мере одной клетки в ферментационном бульоне и в условиях, являющихся пермиссивными для продукции указанного сиалированного олигосахарида; и, возможно,

в) выделение указанного сиалированного олигосахарида.

2. Способ по п. 1, в котором сиалированный олигосахарид выбран из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, LST-a, LST-b, LST-c и DSLNT.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, в котором ферментационный бульон содержит по меньшей мере один источник углерода, при этом указанный по меньшей мере один источник углерода предпочтительно выбран из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, сахарозы, глицерина и их комбинаций.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором ферментационный бульон содержит по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из N-ацетилглюкозамина, галактозы и сиаловой кислоты.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором указанную по меньшей мере одну клетку культивируют при отсутствии и/или без добавления одного или более, выбранных из группы, состоящей из N-ацетилглюкозамина, галактозы и сиаловой кислоты.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором указанную по меньшей мере одну клетку культивируют в присутствии по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из лактозы, лакто-N-триозы II, LNT и LNnT.

7. Генетически модифицированная клетка для получения сиалированных олигосахаридов, где генетически модифицированная клетка содержит гетерологичную сиалилтрансферазу, причем указанная гетерологичная сиалилтрансфераза способна обладать α-2,3-сиалилтрансферазной активностью и/или α-2,6-сиалилтрансферазной активностью для переноса остатка сиаловой кислоты от ее нуклеотид-активированной формы в качестве донорного субстрата к акцепторной молекуле, при этом акцепторная молекула выбрана из группы, состоящей из лактозы, лакто-N-триозы II и олигосахаридов грудного молока.

8. Способ по любому из пп. 1-6 или генетически модифицированная клетка по п. 7, где акцепторная молекула представляет собой олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из трисахаридов, тетрасахаридов и пентасахаридов, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из 3-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, лакто-N-фукопентаозы I и лакто-N-фукопентаозы II.

9. Способ по любому из пп. 1-6 или п. 8 или генетически модифицированная клетка по пп. 7 или 8, где гетерологичная сиалилтрансфераза выбрана из группы, состоящей из:

i. полипептидов, содержащих или состоящих из аминокислотной последовательности, как представлено любой из SEQ ID NO: 1-33;

ii. полипептидов, содержащих или состоящих из аминокислотной последовательности, имеющей сходство последовательности, составляющее по меньшей мере 80%, с любой из аминокислотных последовательностей, как представлено любой из SEQ ID NO: 1-33; и

iii. фрагментов любого из полипептидов i. и ii.

10. Способ по любому из пп. 1-6 или пп. 8-9 или генетически модифицированная клетка по любому из пп. 7-9, где генетически модифицированная клетка содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует гетерологичную сиалилтрансферазу, причем указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

i. нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, как представлено любой из SEQ ID NO: 1-33;

11. нуклеотидных последовательностей, как представлено любой из SEQ ID NO: 34-66;

iii. нуклеотидных последовательностей, имеющих по меньшей мере 80%-ое сходство последовательностей с одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, как представлено любой из SEQ ID NO: 1-33;

iv. нуклеотидных последовательностей, имеющих сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 34-66;

v. нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны любой из нуклеотидных последовательностей i., ii., iii. и iv.; и

vi. фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей i., ii., iii., iv. и v., где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную сиалилтрансферазу в генетически модифицированной клетке.

11. Способ по любому из пп. 1-6 или пп. 8-10 или генетически модифицированная клетка по любому из пп. 7-10, где генетически модифицированная клетка обладает повышенной продукцией одного или более нуклеотид-активированных сахаров, выбранных из группы, состоящей из CMP-N-ацетилнейраминовой кислоты, УДФ-N-ацетилглюкозамина, УДФ-галактозы и ГДФ-фукозы, по сравнению с клеткой перед генетической модификацией.

12. Способ по любому из пп. 1-6 или пп. 8-11 или генетически модифицированная клетка по любому из пп. 7-11, где генетически модифицированная клетка обладает сверхэкспрессией, по сравнению с клеткой перед генетической модификацией, одного или более генов, кодирующих полипептид, способный обладать ферментативной активностью, выбранной из группы, состоящей из следующего: L-глутамин:D-фруктозо-6-фосфат аминотрансфераза, N-ацетилглюкозамин-1-фосфат уридилтрансфераза, глюкозамин-1-фосфат ацетилтрансфераза, фосфоглюкозаминмутаза, глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансфераза, N-ацетилглюкозамин-2-эпимераза, УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимераза, синтаза сиаловой кислоты, фосфоенолпируватсинтаза, синтаза СМР-сиаловой кислоты, УДФ-галактозо-4-эпимераза, галактозо-1-фосфат уридилилтрансфераза, фосфоглюкомутаза, глюкозо-1-фосфат уридилилтрансфераза, фосфоманномутаза, маннозо-1-фосфат гуанозилтрансфераза, ГДФ-маннозо-4,6-дегидратаза, ГДФ-L-фукозосинтаза и фукозокиназа/L-фукозо-1-фосфат-гуанилрансфераза.

13. Способ по любому из пп. 1-6 или пп. 8-12 или генетически модифицированная клетка по любому из пп. 7-12, где клетка не обладает или обладает сниженной активностью, по сравнению с клеткой перед генетической модификацией, одной или более ферментативных активностей, выбранных из группы, состоящей из β-галактозидазы, глюкозамин-6-фосфатдезаминазы, N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы, N-ацетилманнозаминкиназы, N-ацетилманнозамин-6-фосфатэпимеразы и альдолазы N-ацетилнейраминовой кислоты.

14. Способ по любому из пп. 1-6 или пп. 8-13 или генетически модифицированная клетка по любому из пп. 7-13, где один или более генов, кодирующих β-галактозидазу, глюкозамин-6-фосфатдезаминазу, N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазу, N-ацетилманнозаминкиназу, N-ацетилманнозамин-6-фосфатэпимеразу и альдолазу N-ацетилнейраминовой кислоты, были удалены или их экспрессия была инактивирована в генетически модифицированной клетке.

15. Способ по любому из пп. 1-6 или пп. 8-14 или генетически модифицированная клетка по любому из пп. 7-14, где указанная по меньшей мере одна клетка содержит по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из функциональной лактозопермеазы, функциональной фукозопермеазы и функционального транспортера сиаловой кислоты (импортера), предпочтительно содержит и экспрессирует по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую одно, выбранное из группы, состоящей из функциональной лактозопермеазы, функциональной фукозопермеазы и функционального транспортера сиаловой кислоты (импортера).

16. Способ по любому из пп. 1-6 или пп. 8-15 или генетически модифицированная клетка по любому из пп. 7-15, где клетка обладает активностью по меньшей мере одной гликозилтрансферазы, выбранной из группы, состоящей из β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, β-1,3-галактозилтрансферазы, β-1,4-галактозилтрансферазы, α-2,3-сиалилтрансферазы и α-2,6-сиалилтрансферазы.

17. Способ получения сиалированного олигосахарида, включающий:

a) предоставление сиалилтрансферазы в реакционной смеси, причем указанная сиалилтрансфераза способна обладать α-2,3-сиалилтрансферазной активностью и/или α-2,6-сиалилтрансферазной активностью для переноса остатка сиаловой кислоты от ее нуклеотид-активированной формы в качестве донорного субстрата к акцепторной молекуле, при этом акцепторная молекула выбрана из группы, состоящей из лактозы, лакто-N-триозы II и олигосахаридов грудного молока;

b) приведение указанной сиалилтрансферазы в контакт с донорным субстратом и акцепторной молекулой, где акцепторная молекула выбрана из группы, состоящей из лактозы, лакто-N-триозы II и олигосахаридов грудного молока.

18. Применение сиалированного олигосахарида, полученного способом по любому из пп. 1-6 или пп. 8-17, для изготовления питательной композиции, предпочтительно композиции для детей.

19. Питательная композиция, содержащая по меньшей мере один сиалированный олигосахарид, где указанный по меньшей мере один сиалированный олигосахарид получен способом по любому из пп. 1-6 или пп. 8-17.

20. Питательная композиция по п. 19, где питательная композиция содержит 3'-SL и/или 6'-SL в комбинации с по меньшей мере одним нейтральным ОГМ, причем указанный по меньшей мере один нейтральный ОГМ предпочтительно представляет собой 2'-FL.