Бактерицидная композиция для консервирования пищевых продуктов - RU2048151C1

Чертежи

Описание

Изобретение относится к бактериоцидным композициям для использования в качестве усиленных бактерицидов широкого спектра действия и к способам лечения и профилактики микробной инфекции.

Бактериоцины, такие как лизостафин и низин, являются протеинами, продуцируемыми бактериями, которые ингибируют рост и иногда убивают бактерии, близко относящиеся к видам их происхождения. Лизостафин является бактериоцином, который лизирует и убивает практически все известные виды Staphylococcus, но является неактивным против бактерий других родов. Лизостафин, выделенный из культуральных фильтратов Staphylococcus simulans (NRRL B-2628), выращенных в соответствии с опубликованными ссылками, является эндопептидазой, которая расщепляет полиглициновые сшивки пептидоглюкана, найденные в клеточных стенках Staphylococcus. Культуры S. simulans, выращенные в условиях, которые индуцируют продуцирование лизостафина, являются иммунными к бактериоцину, тогда как те же самые культуры, выращенные в условиях, при которых не продуцируется лизостафин, являются чувствительными к бактериоцину.

Лизостафин является природно встречающимся бактериоцином, секретируемым единственным известным штаммом S. simulans, первоначально изолированным и названным Staphylococcus staphylolyticus Шиндлером и Шухардтом. Продуцирование лизостафина S. staphylolyticus уже описано ранее в патенте США N 3278373, выданном 11 октября 1966 года, и в Proceedings of the National Acаdemy of Sciences, 51:414-421 (1964). Единственный организм S. staphylolyticus (NRRL B-2628), который продуцирует лизостафин, был недавно идентифицирован как биовариант S. simulans. Слоаном и др. Int. J. System Bacteriol. 32: 170-174 (1982). Поскольку название S. staphylolyticus не внесено в утвержденный список бактериальных названий, организм, продуцирующий лизостафин, был повторно определен как S. simulans.

Ранее было показано, что действие лизостафина может быть усилено пенициллином и другими антибиотиками (находящаяся на рассмотрении заявка на патент в США N 188 183 Блэкборна и др. поданная 28 апреля 1988 года).

Низин, хотя иногда он рассматривается как пептидный антибиотик, более точно должен быть отнесен к бактериоцинам. Низин продуцируется в природе различными штаммами бактерии Streptococcus lactis. Он является пищевым консервантом, используемым для ингибирования роста спор определенных видов грамположительных бактерий, включая те, что происходят из штаммов Clostridium, ответственных за возникновение пищевого яда ботулизма. Обзор свойств низина сделан Харстом в Advances in Applied Microbiology. 27:85-123 (1981). В публикации описано, что является общеизвестным о низине. Низин, продуцируемый Streptococcus lactis, является коммерчески доступным в качестве нечистого препарата Низаплин ТМ (Эплин энд Баретт.лтд. Дорсет, Англия).

Низин принадлежит к классу пептидов, содержащих лантионин. В этот класс также включены субтилин, эпидермин, циннамицин, дурамицин, анковенин и Пеп 5. Эти бактериоциновые пептиды каждый продуцируется различными микроорганизмами. Однако субтилин, полученный из некоторых культур B. subtilis, и эпидермин, полученный из некоторых культур Staphylococcus epidermidis, имеют молекулярные структуры, очень похожие на структуру низина (Харст, с.85-86; и Шнелл и др. Nature 333:276-278). Полагают, что подобные по структуре пептидные бактериоцины, содержащие дантионин, должны быть эффективными вместо низина в предлагаемом изобретении.

Низин эффективно применялся в качестве консерванта в производстве сыров и молочных продуктов. Использование низина в производстве сырых продуктов было защищено в более ранних патентах (патент США N 4584199, кл. А 23 С 9/12, и N 4597972, кл. В 29 D 29/00). Использование низина для ингибирования роста определенных грамположительных бактериальных спор хорошо документировано (Тейлор, патент США N 4584199, и Тейлор, патент США N 4597972 Цай Сэндин "Конъюгальный перенос плазмидных генов низина из Staphyloccus lactis 7962 в Leuconostoc dextranicum 181" Applied and Environmental Microbiology, с.352 (1987); "Природный консервант", Food Engineering International, с.37-38 (1987); "Focus on Nisin", Food Manufacture c. 63 (1987). Низин иногда встречается естественного происхождения в низких концентрациях в молоке и сыре, и полагают, что он является полностью нетоксичным и неаллергеном для человека. Недавно низин был признан безопасным FDА в качестве прямого пищевого ингредиента в пастеризованной сырной пасте и пастеризованной сырной пасте с фруктами, овощами или мясом. Поскольку низин является белковым соединением, любые остатки в проглатываемой пище быстро разлагаются пищевыми ферментами.

Общая приемлемость низина в качестве пищевого консерванта ограничена указанием на то, что в качестве бактериоцина активность низина ограничивается только теми грамположительными бактериями, которые являются близко родственными к бактериальным видам его происхождения. Кроме того, низин, как было показано ранее, не обладает бактерицидной активностью против грамотрицательных бактерий. Поскольку не являются неожиданными пищевое загрязнение и порча в результате из-за различных грамположительных и грамотрицательных бактерий, следовательно, низин получил только ограниченное применение в качестве пищевого консерванта. Кроме того, из-за ограниченной активности низина как бактериоцина ранее не было указано его применение как такового на наружной стороне пищевого продукта.

Недавно было показано, что композиция, содержащая низин и небактерицидные агенты, такие как хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества, обладает бактерицидной активностью по отношению к широкому кругу видов грамотрицательных бактерий и повышенной активностью по отношению к широкому кругу видов грамположительных бактерий. Например, грамотрицательными бактериями, являющимися чувствительными к улучшенному бактерициду, являются Salmonella typhimirium, Escherichia coli, Klebsiella pneumonial, Рseudomonas aеruginosa, Bacteriоides gingivalis и Actinobacillus actinomycetescomitans. Грамположительными бактериями, являющимися чувствительными к улучшенному бактерициду, являются Staphyloccus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Streptococcus agalactiae и coryneform бактерий (находящаяся на рассмотрении заявка на патент в США Блэкборна и др. под названием "Композиции с низином для использования в качестве улучшенного бактерицида широкого спектра действия", которая является частичным продолжением заявки на патент в США серийный номер 209861, поданный 22 июня 1988 года, которая приведена здесь в качестве уровня техники).

Теперь обнаружено, что активность бактериоцинов, таких как лизостафин и низин, может быть неожиданно увеличена как по общему спектру, так и по величине этой активности при объединении обоих бактериоцинов. Свойства новых бактериоциновых композиций, содержащий лизостафин и низин, также могут быть дополнительно усилены при добавлении хелатирующего агента и/или поверхностно-активных веществ, которые усиливают и расширяют спектр активности низина и лизостафина.

Все новые бактериоциновые композиции настоящего изобретения содержат лизостафин и низин (здесь "композиция"). Бактериоциновая композиция становится бактерицидом более широкого спектра действия (здесь далее "бактерицидом") при растворении или суспендировании в подходящем носителе, например, растворителе или подходящей жидкой, твердой или коллоидной матрице. Новые бактерициды содержат лизостафин в количестве, достаточном, чтобы быть эффективным как бактерицид против Staphylococcus, и низин присутствует в количестве, достаточном, чтобы усилить бактерицидный эффект лизостафина против Staphylococcus. Другие композиции состоят из лизостафина, низина и хелатирующего агента и могут также содержать поверхностно-активное вещество. Эта композиция в носителе дает новый бактерицид, причем лизостафин и низин находятся в том же самом интервале концентраций, что и в композиции лизостафин/низин, а хелатирующий агент находится в количестве, достаточном для усиления бактерицидного действия низина против как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Еще одна композиция состоит из лизостафина, низина и поверхностно-активного вещества. Эта композиция в носителе дает новый бактерицид, в котором поверхностно-активное вещество находится в количестве, достаточном для усиления бактерицидного действия низина и лизостафина против грамположительных бактерий.

Композиции могут быть использованы непосредственно или в носителях для лечения и профилактики бактериальных загрязнений и инфекций при растворении композиции в подходящем растворителе или суспендировании в подходящей матрице и нанесении ее на обрабатываемую площадь или при добавлении ее к другой композиции для борьбы с инфекцией и ее профилактики.

Большинство химических дезинфицирующих веществ является слишком коррозионными или иначе слишком токсичными, чтобы их можно было использовать в пище и во многих медицинских применениях, большинство антибиотиков действует слишком медленно, чтобы быть полезными как дезинфицирующие вещества, и не может быть применено для пищевых продуктов из-за опасности приобретенной антибиотической устойчивости, которая будет сопутствовать такому использованию. Новые бактерициды являются некорроидирующим, нетоксичными, пригодными для использования в пищевых продуктах и на открытых ранах, эффективными против устойчивых к антибиотикам бактерий и быстро действуют против делящихся и неделящихся бактерий, так что могут быть полезными также и как дезинфицирующее средство.

Композиции или бактерициды могут быть включены в мази или покрытия для лечения инфекций, раневые повязки или хирургические импланты и другие лекарства, такие как капли в нос, полоскания, дезинфицирующие растирания, лосьоны. Бактерициды могут быть использованы для очистки медицинских инструментов и т.п. и в некоторых случаях, когда желательна дезинфекция окружающей среды, но где химические гермицидальные вещества неприменимы из-за риска коррозии или иначе токсических остатков. Бактерициды широкого спектра действия особенно пригодны для пищевых применений, таких как обработка мясных продуктов, особенно домашней птицы, яиц, сыров и рыбы или оборудования для упаковки или обработки пищевых продуктов и для контроля и профилактики загрязнений сырых ингредиентов, обработанных пищевых продуктов и напитков бактериальными патогенами и другими микробными организмами, вызывающими порчу.

В отличие от активности большинства гермицидальных веществ широкого спектра действия, которые подвергают опасности наличие сложного органического материала, бактериоциновые композиции и бактерициды предлагаемого изобретения являются эффективными в присутствии органического материала, такого как молоко или сыворотка.

Композиции предлагаемого изобретения содержат лизостафин и низин, лизостафин, низин и хелатирующий агент или лизостафин, низин, хелатирующий агент и поверхностно-активное вещество. Для обеспечения бактерицидов расширенного спектра действия композиции растворяют в подходящем растворителе или суспендируют в подходящей матрице. Композиции, содержащие лизостафин, низин, хелатирующий агент и/или поверхностно-активное вещество, растворенные в подходящем носителе, например водном растворителе или буфере, или суспендированные в подходящей матрице, как полагают, обладают широким спектром быстрой бактерицидной активности против грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Предпочтительно композицию растворяют в жидком носителе или суспендируют в жидкой, коллоидной или полимерной матрице, так что лизостафин находится в бактерициде в количестве от 0,1 до 100 мкг/мл, и его действие усиливается за счет наличия бактериоцина низина в количестве от 0,1 до 300 мкг/мл, а полученный в результате бактерицид является значительно более бактерицидным по отношению к Staphylococcus, чем один лизостафин. Как полагают, суммарная бактерицидная активность такого нового бактерицида дополнительно усиливается, и он становится более эффективным против широкого спектра как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, когда низин в бактерициде усиливается хелатирующим агентом, как указано в находящейся на рассмотрении заявке на патент Блэкборна и др. озаглавленной "Низиновые композиции для использования в качестве улучшенных бактерицидов широкого спектра действия". Сочетание лизостафина, низина и хелатирующего агента также может дополнительно расширить бактерицидную активность при добавлении к нему поверхностно-активного вещества, на что также указано в заявке Блэкборна и др.

Например, низин активируется и усиливает активность по отношению к широкому спектру грамположительных бактерий с помощью такого хелатирующего агента, как ЕДТА в количестве от 0,1 до 20,0 мМ. В присутствии ЕДТА низин обладает бактерицидной активностью против грамотрицательных организмов, а его активность против грамположительных бактерий увеличивается, и он является активным в более широком интервале рН и по отношению к более широкому спектру грамположительных бактерий. В дополнение к этому наличие поверхностно-активного вещества в количестве 0,01-1,0% в бактерициде улучшает эффективность низина по отношению к грамположительным бактериям. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, полиоксиалкилфенолы (например, тритон Х-100), полиоксиалкилсорбитаны (например, Твины), и глицериды (например, монолаурин и диолеаты). Подходящие ионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, эмульгаторы, жирные кислоты, четвертичные соединения и анионные поверхностно-активные вещества (например, додецилсульфат натрия), и амфотерные поверхностно-активные вещества, например кокамидопропилбетаин.

Подходящие носители для бактерицидов предлагаемого изобретения включают, но не ограничиваются ими, общепризнанные водные буферы. Подходящие матрицы для суспензий новых композиций предлагаемого изобретения включают, но не ограничиваются ими, органические растворители, коллоидные суспензии и полимеры, совместимые с бактерицидом.

Лизостафин, использованный в изобретении, может быть получен техникой ферментации, где S. simulans выращивают в жидкой культуре. Такие техники ферментации описаны в патенте США N 3278378 и в Procеedings of the National Academy of Sciences, 51:414-421 (1964). Уже были сделаны различные усовершенствования в получении лизостафина путем ферментации в патентах США N 3398056 и N 3594284. В последних двух ссылках описаны усовершенствования в культуральной среде и в технике инокуляции, в результате которых получение лизостафина путем ферментации может быть ускорено и улучшено.

Кроме того, лизостафин может быть получен при продуцировании рекомбинантными микроорганизмами, включая штаммы Escherichia coli, Bacillus subtilus и Bacillus sphaericus.

Способ получения лизостафина из микроорганизмов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, кодирующими ген лизостафина, полностью описан в заявке на патент США N 034464, которая является частичным продолжением заявки на патент в США N 852407. Обе заявки приведены здесь в качестве уровня техники. Предпочтительно лизостафин получают из B. sphaericus штамм 00, содержащего рекомбинантную плазмиду, которая направляет синтез лизостафина. Она обеспечивает получение высоких уровней лизостафина, практически свободного от стафилококковых иммуногенных загрязнений, и облегчает очистку лизостафина, так как лизостафин накапливается непосредственно в среде роста. Было найдено, что для этих целей особенно пригодны трансформанты B. sphaericus, содержащие плазмиды рВС16-1L или pROj 6649-IL, хотя другие штаммы также являются полезными в качестве источника лизостафина. Эти плазмиды полностью описаны в вышеупомянутых заявках, находящихся на рассмотрении.

Продуцируемый S. simulans во время экспоненциального роста лизостафин сначала секретируется в виде неактивного предшественника, который перерабатывается экстраклеточно в зрелый активный бактерицин с помощью протеазы, продуцируемой в стационарной фазе роста. В противоположность природному получению лизостафина, лизостафин, полученный с помощью рекомбинантного штамма B. sphaericus, как описано в заявке на патент в США N 034464, накапливается внеклеточно в виде зрелого активного белка во время экспоненциальной фазы роста.

Низин может быть получен коммерчески в виде нечистого препарата Низаплин ТМ из фирмы Эплин энд Баретт. лтд. Дорсет, Англия, и может быть получен при выделении низина природного происхождения из культур Streptococcus lactis с последующим концентрированием низина известными способами. Также сообщалось о способах получения низина с использованием измененных штаммов Streptococcus (Гонсалес с сотр. патент США N 4716115, выдан 29 декабря 1978 года). Также можно получать низин с помощью рекомбинантной ДНК. Низин является членом семейства бактериоцинов, содержащих лантионин. Полагают, что благодаря структурному подобию другие бактериоцины, содержащие лантионин, будут также эффективны в сочетании с лизостафином, как и низин.

Следующие неограничивающие примеры будут иллюстрировать изобретение и покажут эффективность новых бактерицидов с расширенным спектром действия. Полагают, что поскольку степень и спектр активности низина также повышаются хелатирующими агентами, композиции лизостафина, низина и хелатирующего агента также образуют новые бактерициды с повышенной бактерицидной активностью по сравнению с композициями из одних лизостафина и низина.

Все тесты в последующих примерах осуществлены при 37^оС. Эффективность бактерицидов с расширенным спектром действия была определена при анализе бактерицидной активности путем измерения процента бактерий, выживших после обработки бактерицидом. Обычно после инкубации 10⁷ клеток на 1 мл суспензии видов-мишеней с новым бактерицидом в течение определенного промежутка времени бактерии собирают центрифугированием в течение 2 мин. Бактериальный шарик промывают для удаления бактерицида свободным буфером, называемым здесь фаговым буфером (50 мМ трис-HCI буфер рН 7,8, 1 мМ MgSO₄, 4 мМ CaCl₂, 0,1 М NaCl и 0,1% желатина), повторно суспендируют и сериально разбавляют фаговым буфером и наносят 100 мкл суспендированных бактерий на пластине с питательным агаром. Определяют выжившие бактерии в единицах оценки образования колоний (CFU) после инкубации в течение 24-48 ч при 37^оС. Согласно предлагаемому изобретению эффективным бактерицидом является бактерицид, который позволяет выжить менее 0,1% от первоначально живых бактерий.

П р и м е р 1. Лизостафин и низин.

Суспендируют и инкубируют в молоке при 37^оС в течение 2 ч клетки Staphylococcus aureus с различными концентрациями лизостафина, низина или сочетания лизостафина и низина в молоке. Бактерицидная эффективность бактерицидов была оценена путем определения процента выживших бактерий, как определено выше. Результаты такого эксперимента приведены в табл. 1.

Один низин в молоке обладает практически малой бактерицидной активностью по отношению к Staphylococcus. Один лизостафин в молоке является бактерицидным по отношению к S. aureus и может продуцировать более чем пять log снижение выживших клеток при концентрации 1,0 мкг/мл. Лизостафин при объединении с низином в молоке обеспечивает композицию, которая является новым бактерицидом, в результате чего бактерицидная активность является значительной и неожиданно превышает ту, которая имеется у любого одного бактерицина и является более активной, чем для ожидаемого суммарного эффекта. Это лучше всего показано при ограниченной концентрации лизостатина (0,1 мкг/мл), показанной в табл. 1. Следовательно, когда применение лизостафина ограничивается присущей ему активностью, бактериоциновая композиция, состоящая из лизостафина и низина в подходящем носителе, таком как молоко в этом примере, обеспечивает бактерицид с расширенным спектром действия.

П р и м е р 2. Лизостафин + низин + ЕДТА + поверхностно-активное вещество.

Данные табл. 2 иллюстрируют мощность нового бактерицида-композиции, состоящей из лизостафина, низина, ЕДТА и моноглицеридного поверхностно-активного вещества, по отношению к S. aureus и S. agalaсtiae в молоке, сложной пищевой среде. Ранее было показано, что низкие концентрации ЕДТА усиливают активность низина, тогда как более высокие концентрации ЕДТА ингибируют активность низина (находящаяся на рассмотрении заявка Блэкборна и др.). В молоке более высокие концентрации ЕДТА являются меньшими ингибиторами бактерицидной активности бактериоциновой композиции.

Реферат

Использование: бактерицидная композиция широкого спектра действия. Сущность изобретения: композиции могут быть растворены или суспендированы в подходящем растворителе или матрице и являются более активными по отношению к более широкому спектру бактерий, чем любая из составляющих ее частей. Композиции включают лизостафин и пептидный бактериоцин, содержащий латионин, хелатирующий агент и поверхностно-активное вещество. 2 з. п. ф-лы, 2 табл.

Формула