Новая фитаза, способ ее получения и ее применение - RU2017118157A
Код документа: RU2017118157A
Формула
1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты
i) содержащая нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, кодирующую белок с фитазной активностью, или
ii) обладающая идентичностью последовательности по меньшей мере 83% с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, кодирующей белок с фитазной активностью.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты не включает нуклеотидную последовательность, кодирующую N-концевой сигнальный пептид.
3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит кодон-оптимизирующие мутации, учитывающие особенности организма клетки-хозяина.
4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, отличающаяся тем, что организм клетки-хозяина представляет собой Pichia pastoris.
5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты отличается от соответствующей кодирующей нуклеотидной последовательности дикого типа наличием не менее 50 кодон-оптимизирующих мутаций.
6. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, отличающаяся тем, что по меньшей мере 50% кодонов соответствующей нуклеотидной последовательности дикого типа заменены на кодоны, наиболее часто используемые организмом клетки-хозяина.
7. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, отличающаяся тем, что все кодоны выделенной молекулы нуклеиновой кислоты заменены на кодоны, наиболее часто используемые организмом клетки-хозяина.
8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, кодирующая аминокислотную последовательность белка с фитазной активностью в соответствии с SEQ ID NO: 3.
9. Экспрессирующая конструкция, содержащая нуклеотидную последовательность по любому из пп. 1-8, функционально связанную с элементами, регулирующими экспрессию нуклеотидной последовательности.
10. Экспрессирующая конструкция по п. 9, отличающаяся тем, что элементы, регулирующие экспрессию, включают промотер, функционирующий в клетке-хозяине и, необязательно, терминирующую последовательность.
11. Экспрессирующая конструкция по п. 9 или 10, отличающаяся тем, что клетка-хозяин является клеткой гриба.
12. Экспрессирующая конструкция по п. 11, отличающаяся тем, что клетка гриба является клеткой Pichia pastoris.
13. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по пп. 1-8 или экспрессирующую конструкцию по любому из пп. 9-12.
14. Способ получения белка, имеющего фитазную ферментативную активность, включающий этапы:
a) введение в клетку-хозяина вектора, i) содержащего элементы, регулирующие экспрессию, функционирующие в клетке-хозяине; и ii) функционально связанного с молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 или 2;
b) культивирование клеток-хозяев, полученных на этапе a) в условиях, подходящих для экспрессии белка, и, при необходимости,
c) выделение белка, полученного на этапе b), из культуры клеток.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что элементы, регулирующие экспрессию, включают в себя промотор, функционирующий в клетке-хозяине и, при необходимости, терминирующую последовательность.
16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что клетка-хозяин является дрожжевой клеткой.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что дрожжевая клетка является клеткой Pichia pastoris.
18. Способ по п. 17, в котором экспрессия белка осуществляется с использованием метанольной системы экспрессии.
19. Способ по п. 14, отличающийся тем, что белок, выделенный на этапе c), обладает фитазной активностью по меньшей мере 1000 единиц/л.
20. Способ по любому из пп. 14-19, отличающийся тем, что этап выделения включает a) отделение секретируемого белка от компонентов среды и/или b) отделение белка от компонентов клетки-хозяина.
21. Белок, полученный способом по любому из пп. 14-20.
22. Применение белка по п. 21 или полученного способом по любому из пп. 14-20 для изготовления добавок в корм для животных.
23. Добавки в корм для животных, содержащие белок по п. 21 или содержащие белок, полученный способом по любому из пп. 14-20.
