Способ получения каротиноидов или их предшественников с помощью генно-инженерно видоизмененных микроорганизмов семейства blakeslea, полученные указанным способом каротиноиды или их предшественники и их применение - RU2005125072A

Реферат

1. Способ получения каротиноидов или их предшественников с помощью генно-инженерно видоизмененных микроорганизмов семейства Blakeslea, включающий в себя следующие этапы:

(i) трансформация по меньшей мере одной клетки,

(ii) гомокариотизация полученных в пункте (i) клеток, таким образом, чтобы получались клетки, все ядра которых были бы одинаковым образом видоизменены по одному или нескольким генетическим признакам, и которые одинаковым образом проявляли бы это генно-инженерное видоизменение, и

(iii) селекция и размножение генно-инженерно видоизмененной клетки или клеток,

(iv) культивирование генно-инженерно видоизмененных клеток,

(v) получение продуцируемых генно-инженерно видоизмененными клетками каротиноидов или продуцируемых генно-инженерно видоизмененными клетками предшественников каротиноидов.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что речь идет о клетках грибов вида Blakeslea trispora.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что при трансформации (i) используется генетический вектор или свободные нуклеиновые кислоты.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что применяемый при трансформации (i) вектор встраивается в геном по меньшей мере одной клетки.

5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что применяемый при трансформации (i) вектор содержит промотор и/или терминатор.

6. Способ по п.3, характеризующийся тем, что при трансформации (i) применяется вектор, содержащий промотор gpd, pcarB, pcarRA и/или ptef1 и/или терминатор trpC.

7. Способ по п.3, характеризующийся тем, что при трансформации (i) применяется вектор, содержащий какой-либо ген устойчивости.

8. Способ по п.7, характеризующийся тем, что применяемый при трансформации (i) вектор содержит ген устойчивости к гигромицину (hph), в частности, выделенный из Е.coli.

9. Способ по п.6, характеризующийся тем, что промотор gpd включает в себя последовательность SEQ ID NO: 1, промотор tef1 - последовательность SEQ ID NO: 35, а терминатор trpC - последовательность SEQ ID NO: 2.

10. Способ по п.6, характеризующийся тем, что промотор gpd и терминатор trpC берутся из Aspergillus nidulans.

11. Способ по п.3, характеризующийся тем, что применяемый вектор включает в себя последовательность SEQ ID NO: 3.

12. Способ по п.1, характеризующийся тем, что трансформация (i) осуществляется посредством бактерий Agrobacterium, конъюгации, химических агентов, электропорации, обстрела несущими ДНК частицами, с помощью протопластов или микроинъекции.

13. Способ по п.1, характеризующийся тем, что при гомокариотизации (ii) применяются мутагенные агенты.

14. Способ по п.13, характеризующийся тем, что в качестве мутагенных агентов используются N-метил-N'-нитро-нитрозогуанидин (MNNG), ультрафиолетовое облучение или рентгеновское излучение.

15. Способ по п.1, характеризующийся тем, что селекция осуществляется путем мечения и/или отбора моноядерных клеток.

16. Способ по п.1, характеризующийся тем, что при селекции применяются 5-карбон-5-деазарибофлавин (darf) и гигромицин (hyg) или 5-фторротат (FOA), а также урацил и гигромицин.

17. Способ по п.3, характеризующийся тем, что применяемый при трансформации (i) вектор содержит генетическую информацию, информацию, необходимую для выработки каротиноидов или их предшественников, или каротинов или ксантофиллов.

18. Способ по одному из пп.3-17, характеризующийся тем, что применяемый при трансформации (i) вектор содержит генетическую информацию, необходимую для выработки астаксантина, зеаксантина, эхиненона, бета-криптоксантина, андониксантина, андонирубина, кантаксантина, 3-гидроксиэхиненона, 3'-гидроксиэхиненона, ликопина, бета-каротина, альфа-каротина, лютеина, биксина, фитофлюена или фитоена.

19. Способ получения, по меньшей мере, одного высоко очищенного каротиноида и пищевого продукта, в состав которого входят клетки продуцирующих каротиноиды микроорганизмов и по меньшей мере один каротиноид, включающий в себя после культивирования продуцирующих каротиноиды генетически видоизмененных микроорганизмов семейства Blakeslea по одному из пп.1-18 следующие этапы:

I) отделение биомассы,

IA) при необходимости промывка биомассы не растворяющем каротиноиды растворителем, предпочтительно, водой,

IB) стерилизация и разрушение клеток полученной биомассы,

IC) при необходимости сушка и/или гомогенизация,

II) частичная экстракция каротиноидов из биомассы разрушенных клеток с помощью растворяющего каротиноиды растворителя и удаление этого растворителя из биомассы,

IIA)

1) удаление остатков растворителя из содержащей каротиноиды биомассы,

2) при необходимости гомогенное суспендирование с содержанием твердой фазы более 2% и менее 50%,

3) сушка биомассы или, соответственно, суспензии для получения пищевых продуктов,

IIB)

1) кристаллизация каротиноидов из применяемого растворителя и выделение кристаллов каротиноида, предпочтительно, путем фильтрации.

20. Способ по п.19, характеризующийся тем, что по меньшей мере один из каротиноидов выбирается из группы, состоящей из каротинов и ксантофиллов.

21. Способ по п.19, характеризующийся тем, что по меньшей мере один из каротиноидов выбирается из группы, включающей в себя астаксантин, зеаксантин, эхиненон, бета-криптоксантин, андониксантин, андонирубин, кантаксантин, 3-гидроксиэхиненон, 3'-гидроксиэхиненон, ликопин, бета-каротин, лютеин, фитофлюен, биксин и фитоен.

22. Способ по п.21, характеризующийся тем, что по меньшей мере один из каротиноидов представляет собой астаксантин, зеаксантин, биксин или фитоен.

23. Способ по п.19, характеризующийся тем, что стерилизация и разрушение клеток осуществляется посредством обработки водяным паром или микроволновым излучением.

24. Способ по п.19, характеризующийся тем, что экстракция каротиноидов из биомассы осуществляется при помощи метиленхлорида или сверхкритического диоксида углерода или тетрагидрофурана.

25. Способ по п.24, характеризующийся тем, что растворенные в сверхкритическом диоксиде углерода каротиноиды выделяют непосредственно или переносят в метиленхлорид.

26. Способ по п.19, характеризующийся тем, что экстракция каротиноидов из биомассы осуществляется в один или при необходимости несколько этапов.

27. Способ по п.19, характеризующийся тем, что удаление растворителя из биомассы на этапе IА1) осуществляется путем перегонки с водяным паром.

28. Способ по п.19, характеризующийся тем, что сушка на этапе IIА3) осуществляется посредством распылительной или контактной сушки.

29. Способ по п.19, характеризующийся тем, что кристаллизация на этапе IIВ1) осуществляется путем постепенного замещения растворителя не растворяющим каротиноиды растворителем.

30. Способ по п.29, характеризующийся тем, что замещение применяемого растворителя осуществляется водой или низшими спиртами, в частности, метанолом.

31. Способ по п.1, характеризующийся тем, что генно-инженерно видоизмененный микроорганизм семейства Blakeslea получают посредством трансформации с помощью вектора, содержащего последовательность из группы, включающей в себя последовательности SEQ ID NO: 37-51 и 62.

32. Способ получения пищевого продукта, в состав которого входят клетки микроорганизма семейства Blakeslea и, по меньшей мере, один каротиноид, и состоящий после культивирования продуцирующих каротиноиды генетически видоизмененных микроорганизмов семейства Blakeslea по одному из пп.1-18 из следующих этапов:

I) гомогенное суспендирование твердой фазы культурального бульона,

IIA) при содержании твердой фазы в культуральном бульоне более 2%,

1) при необходимости концентрированно культурального бульона для увеличения содержания твердой фазы менее 50%,

2) сушка культурального бульона для получения пищевых продуктов,

IIB) при содержании твердой фазы в культуральном бульоне менее 2%,

1) концентрация культурального бульона до содержания твердой фазы более 2% и менее 50%,

2) сушка полученной суспензии для получения пищевых продуктов,

IIC) независимо от содержания твердой фазы в культуральном бульоне,

1) отделение биомассы,

2) при необходимости промывка биомассы не растворяющем каротиноиды растворителем, предпочтительно, водой,

3) стерилизация и разрушение клеток,

4) при необходимости сушка и гомогенизация,

5) частичная экстракция каротиноидов из биомассы с помощью растворяющего каротиноиды растворителя,

5а) отделение содержащей каротиноиды биомассы от содержащего каротиноиды растворителя,

5b) удаление остатков растворителя из биомассы и

5с) сушка биомассы для получения пищевых продуктов,

6) кристаллизация каротиноидов из применяемого в пункте 5а) растворителя и выделение кристаллов каротиноида, предпочтительно, путем фильтрации.

33. Способ по п.32, характеризующийся тем, что по меньшей мере один из каротиноидов выбирается из группы, состоящей из каротинов и ксантофиллов.

34. Способ по п.32, характеризующийся тем, что по меньшей мере один из каротиноидов выбирается из группы, включающей в себя астаксантин, зеаксантин, эхиненон, бета-криптоксантин, андониксантин, андонирубин, кантаксантин, 3-гидроксиэхиненон, 3'-гидроксиэхиненон, ликопин, бета-каротин, лютеин, биксин, фитоен.

35. Способ по п.32, характеризующийся тем, что по меньшей мере один из каротиноидов представляет собой астаксантин, зеаксантин, биксин или фитоен.

36. Способ по п.32, характеризующийся тем, что стерилизация и разрушение клеток на этапе II3) осуществляется посредством обработки водяным паром или микроволновым излучением.

37. Способ по п.32, характеризующийся тем, что экстракция каротиноидов из биомассы на этапе IIC5) осуществляется при помощи метиленхлорида или сверхкритического диоксида углерода.

38. Способ по п.37, характеризующийся тем, что растворенные в сверхкритическом диоксиде углерода каротиноиды выделяют непосредственно или переносят в метиленхлорид.

39. Способ по п.32, характеризующийся тем, что экстракция каротиноидов из биомассы осуществляется в один или несколько этапов.

40. Способ по п.32, характеризующийся тем, что удаление растворителя из биомассы на этапе IIC5b) осуществляется путем перегонки с водяным паром.

41. Способ по п.32, характеризующийся тем, что сушка на одном из этапов IIA1), IIB2) или IIС5с) осуществляется посредством распылительной или контактной сушки.

42. Способ по п.32, характеризующийся тем, что кристаллизация на этапе IIС6) осуществляется путем постепенного замещения растворителя не растворяющим каротиноиды растворителем.

43. Способ по п.42, характеризующийся тем, что замещение применяемого растворителя осуществляется водой или низшими спиртами, в частности, метанолом.

44. Способ по одному из пп.32-43, характеризующийся тем, что генно-инженерно видоизмененный микроорганизм семейства Blakeslea получают посредством трансформации с помощью вектора, содержащего последовательность из группы, включающей в себя последовательности SEQ ID NO: 37-51 и 62.

45. Применение полученных согласно способу по одному из пп.1-18 каротиноидов для приготовления косметических, фармацевтических или дерматологических составов, пищевых продуктов, пищевых добавок, кормов для животных или кормовых добавок.