Способ получения фермента,фиксированного на твердом носителе - SU515460A3

Описание

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕ Т/, ФИКСИРОВАННОГО НА ТВЕРДОМ 1- ОСИТЕЛЕ Целлюлозу 1редБарптельно обра6ать вают щелочным pacтБOpo y; затем промьюануг- и диспергируют в органической жидкости (кейтралЬ )НОЙ или слабоосновной). После введе кия агента хлорирования в дисперсию целлютечение нескольких часов при темпелоз fji в предпочтителько С осушестратуре в)ь1ют выдержку реаг фующих cHCTevr, а затем целлюпооу выделяют, промьюают и при необходимости сушат. Целесообразнее цобавлягь горируюишй агент к дисперсии целлю-лозЕ-л гюстененно. Затем осуществляют контакт обработанной целлюлозы с буферным раствором фер мента при рН последнего 5,,0-10,0 и температуре ниже 45 С, Длительность контак ,та для фиксации фер тента на целлюлозе 2448 час. Количество расходуемого к весу активированной аеллюлоз,: составляет 1-60 асс.%. К группе фер -1е ;тоВ5 способных завать комплексные соедир.ония с активированной целлюлозой, ОТ1ЮСЯТС.П инвертаз/л, лмилаза, мальтас5а, пектииаза, я;:1отеазь,. пептидазы, трипсин, химотрипсрпц лизоцим , фосфотазь, рибонуклеазы. Особое место а. нимают сычуукньй фермент, бета-г;;лакт -гдаза и химо трипсин. Желательно, чтобы Ци/(Л.юлозньш но ситель содержал около 5-25% лигнина по гзесу сухого вещества. Для получения такой целлюлозы можно использовать щепу, опилки , солому, а также бумажную массу при условии содержания лигнина в указ знных пределах. /Можно применять также стержни ночатка к тсурузы. Размер частиц целлюло зы от 0,2 мм до нескольких сантиметров {предпочтительно О,5-5 мм). Наиболее хорошие резу.льтаты получают при использовании стержней початка кукуру зы в кусках О,5-1О Mtyt, обработанных хлоРИДОМ тяонила в гфисутствии избытка пиридина и содержащих в х-отовом виде 2-6 % серы и хлора менее 1 %. Чтобы получить фермент, фиксировапньш на лигч;ифн1шрованной целлюлозе, последнюю {соцержащую лигнин) измельчают, полученные куски обрабатьюают вначале щелочи ьгк раствором, растворяя находящийся на их по верхности лигнин, затем куски (зерна) целлюлозы промывают хо.лодпой водой, обезвоживают спиртом и промывают пиридином, вводя в суспензию хлорид тионила и поддерживая темиературу на уровне 55-60 С, чСпу тя час суспензию охлаждают, выделяют зерна , промывают водой, затем раствором кислоты с рН близким к 2,0, спиртом и супзт при температуре ниже 50 С. Нанесение фермента на полученный нс/с тель осуществляют в среде буферного водно го раствора при рН 5,9-6,4 и температуре vO-.tf С в течение 24 час. Затем зерна с г Aije.;e.. ферментом вьщеляют, цромьтают бзферным раствором с соответствующим рН п -ВОДОЙ. Хранить полученные зерна рекомендуется при относитепьно низкой температуре в буферном растворе при рН, обеспечиваюгаем устойчивс(зть фермента. Пример 1. Хпорирование цаплю - лозы 3 присутствии пиридина. Цегшюлоау в количестве 32,4 г обра- б.:ггьша.чи IS/o-KbiM водным раствором гидроокиси яатрик s течение 2 час. Затем ее проь..5ьюапи мета1: олом до тех пор, пока фильтраты перестанут быть основными, и гафидином. После этого ее суспендируют в 800 мл Г1ирид(;нг:, К суспензии добавляют 146 мл хлорида тконияа с чистотой 99 % м ост авляют в покое 4 час, поддерживая 28 С. Сщстя это время получен - ную смесь вносят в ванну ледяной воды и перемэш1-тают 1 час. Затем целлюлозу отфилгьфовыэийУг и готовят из нее и из рас-твора сьл: 1.енного двууглекислого натрия суспе«-31-,ю. которую через сутки промывают водой. Полученную целлюлозу сушат 24 чгс при 50 С, В ней содержится 3,57% хлора и 4j4% серы. Опытами у-,:7а-ьювлено5 что в среде пиридина сера фиксируется на целлюлозе Б течение первого часа реакции и,если one- рахшю продолжать :ас.и 28 С, то содержание ее понижается. Количество фиксиро - вайного хпора наоборот повыашется спустя незрвьш iJi.: рвакШ1И. Пример 2. Хлорирование целлюлозы в присутствии дичжсг.ка. Готовят суспензию из СО г целлюлозы и 450 M.TI диоксана. Добаь.яют 30 мл хлоряда тиснила. После 1 -sacu реакции смесь фильтруют, щ;о:льжают вг:;:;.: и сушат. Содержание хлора в целлюлозе 1,51%. Если повысить количество хлорида тиопила при получении реакционной смеси (или время реакпли), то содержание .хлора в целлюлозе не увеличивается. Пример 3. Обработка целлюлозы хлористым сульфирилом. Обработку целлюлозы ведут аналогично гфимеру 1, но вместго гооридина используют 44 мл хлористого сульфурила, т. е. 0,50 моля. П р и м е р 4. Обработка целлюлозы в присутствии трихлорида фосфора. Обработку целлюлозы ведут аналогично примеру 3, но используют 50 мл трихлорида фосфора, т. е. 0,6 моля. П р и м е р 5. Обработка целлюлозы пентахлоридом фосфора. Процесс осуществляют аналогично примеру 4, но используют 62,5 г пентахлорида фосфора или 0,3 моля, предварительно растворенного в диоксане. Таким образом , используют одновременно гафид1гн и диоксан. Пример 6. Приготовление комплек сного соединения целлюлоза-сыч жный фермент . Сульфо-хлорированную иеллюпозу в количестве 16 г, согласно примеру I, вводят в контакт с 4О мл раствс эа промьглленного сычужного фермента, разбавленного пятикратным количеством буферного раствора фосфата 1ФИ рН 6,2. Поддерживают температуру между 4 и 6 С при перемеатвании. Спуотя 48 час целлюлозу промьшают в 250 мл буферного раствора фосфата при рН 6,2 25О мл водного раствора хлористо го натрия (5 молей/литр) и 250 мл воды. Затьм комплексное соединение снова суспендируют в 250 мл буферного раствора апетата при рН 454-5 температуре 4-6 С и перемешивании в течение 1 час. Эту обработку проводят для десорбции ковалентной связью не фиксированной фракции фермента. После новой фильтрации не растворенный фермент возвращают и суспендируют с 250 мл буферного раствора ацетата в течение 20 час. После послед ней фильтрации полученное комплексное сое динение целлюлоза-сычужньш фермент диспергируют в 100 мл этого буферного раствора ацетата ггри рН 4,4 и оно со фаняет- ся в холодильнике при 4-6 С. Активность 16 г этого комплексного соединения эквивалентна 0,12 мл промы Ш1енкого сычужного фермента. Пример 7. Комплексное соединени целлюлоза-х м отрипсии, Вводят в трубки из пластмассы для цен трифуги 5ОО мг целлюлозы, обработаннсй согласно примеру 2, добавляют 1О мл буферного ферментативного раствора при рН 9 (борная кислота, /хлористый калий/ хлорис тый натрий), обозначенного маркой титри- зол. Трубки помешают на виброшнт на 1О мин при комнатной температуре. Затем про изводят их центрифугирование в течение 20 мин со скорос гью 25ОО об/мин. Уда ляют всплывшую часть, осадок промывают для десорбции части фермента, которая не фиксировалась, 10 мл раствора хлористого натрия, содержащего 5 молей хлористого натрия на 1 л. После перемешивания снова производят центрифугирование в течение 20 мин. Остаток обрабатывают буферным раствором при рН 8,5, известны { под назBaiffleM трис, состоящим из амино-2 гидроксиметил-2 пропандиол-1,3, и 10 мл ти ризола при рН 9. Проводят еще две промьеки, после чего обработанную целлюлозу сушат. Протеолитическая активность полученно го сухого ломплеконого соедЕнекия опре- деляетсй на казешге гсри рН 8,5 и температуре 37 С. Для ЭТО1Х1 в когшческую колбу вносят 800 мг комплексного соедине - ния и 2О мл раствора казенна (или снятого молока), спустя Ю мин отбирают Юмл раствора, который выгажают в пробгфку, содер чащую 10 мл трихяоруксусной кислоты для остановки реакции. Затем пробир - ку помешают на 1/2 час в вашту. где под- отО/-держивают 37 С, для осаждения всего казеина , который не был гидролизован. Фильтруют и определяют количество вьщелен - кого тирозина измерением оптической плот кости фильтрата при длине волны 275ОА. Taicif образомJ находят, что активность 50О Ml- комплексного соединения пеллюлозахимотрипсика сравнима с активностью 0,8 мг свободного трипсина по отношению к 1О М.1 снятого молока в тех же уело - Пример 8. Комплексное соедине- пне трипснн-целлюлоза. 4 г носителя, приготовленного согласно примеру 2j вводят в кош1ческую Лолбу с 8О мл ферментат1тного раствора, содержащего 2ОО мг трипсина и 1ОО мл буферного раствора титризола при рН 9. Пере- меш нвают в термостате и оставляют на 10 мин ЩУК 37 С, Затем фильтруют на 4ритирован(юм CTeiciie ь промьюают ком плексное соедикенме 7О мл иодиог-о раствора с 5 молями хлористого катри.к .i 1 л. Вторую и промьшкн ;троБоаят соответственно с 50 к ЗО мл гот-о же раствора хлорнстого нптрмя. Получеикое комплексное сое-цк;;ег&1е ссхра51яют в бу ферном раегворе при рН 8.5. Лрг теол итическая активность 50О vir комплексного соединения, стфеделенная на каоеипе при рЬ; 8j5 к 37С, соответствует активности 0,4 мг СБободкого трипсина, Пример 9. Комплексное соединение бета-га ла ктозидава-целлюлоза. К 13 г модифкщфованной согласно примеру 1 целлюлозы добавляют 4О мл ферментативного раствора, разбавленного в Ю мп буферного раствора при рН 7,2, состошле- го из 10 маль/л фосфата калия и 10 моль/л хяористого магния. Ферментптивньш раствор представляет co6oi4 целлюларный экстракт Esclie г i-с hid Cofci, К 12, очнщенный путем осаждения сульфатом аммония , содержащий 18ОО ед. о-нитрофени.л-бета-ТЗ- галактопиранозида (О. П. П. Г.). Перемешивают смесь в течение 48 час при 40 С, После первой фильтрации комплекс- ное соединение промывают п суспенд1фуют

Реферат

Формула